微小RNA介導的牙周炎與動脈粥樣硬化相關機制的研究進展

2020-9-9 10:09  來源:國際口腔醫學雜志
作者:周婕妤 劉琳 吳亞菲 趙蕾 閱讀量:12117

    動脈粥樣硬化性血管疾?。╝therosclerotic vascular disease)是嚴重影響人類健康的疾病之一,可導致腦卒中、冠心病及外周動脈疾病等心腦血管疾病,是最常見的死亡原因?,F研究普遍認為動脈粥樣硬化性血管疾病是一種慢性血管炎癥性疾病,免疫炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生、發展到斑塊破裂的各個階段均發揮重要作用。

    牙周炎是發生在牙齒支持組織的慢性炎癥破壞性疾病。大量研究已證實慢性牙周炎是心血管疾病的獨立危險因素。其主要潛在致病機制包括全身炎癥負荷增加和細菌造成的動脈直接損傷。牙周微生物可通過血液循環系統直接侵入血管內皮細胞層,或通過免疫細胞成為細胞內寄生菌間接侵入血管壁,促發機體免疫應答,引起多種炎癥介質水平升高,促進動脈粥樣硬化斑塊形成和發展,心腦血管疾病風險增加。

    微小RNA(microRNA)是由內源性基因編碼的長度約為22 nt的非編碼單鏈短RNA分子,可結合靶基因3’-非編碼區域,進而降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA的翻譯,在表觀遺傳學水平調控基因表達。它廣泛存在于各種類型細胞中,參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程;進而調控多種類型疾?。ㄈ缧难芗膊?、糖尿病、癌癥、類風濕性關節炎等)的發生、發展。

    大量研究顯示,在病原體感染宿主細胞的過程中,可通過誘導microRNA水平變化調控宿主細胞對病原體反應的能力。炎癥反應過程誘導多種microRNA產生,反過來這些microRNA又能通過調節Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號成分和免疫調節相關基因防止過度的促炎反應。有學者在牙周致病菌引起的機體免疫應答過程中發現多種microRNA水平改變,而這些microRNA與動脈粥樣硬化疾病的發生、發展密切相關。因此,本文就牙周致病菌通過microRNA調控動脈粥樣硬化發生、發展相關研究進展進行綜述,以期為牙周炎與動脈粥樣硬化疾病關聯的分子機制研究提供新的思路。

    1.牙周炎患者局部和全身microRNA表達特征

    1.1 牙周炎組織中的microRNA表達特征

    microRNA在維持牙周穩態及影響牙周炎的發生、發展中起關鍵作用。大量臨床研究發現,健康者和慢性牙周炎患者牙齦組織中microRNA表達譜存在差異,但由于種族人群及實驗方法的不同,各研究之間關于microRNA的表達譜變化檢測結果并非完全一致。Lee等將慢性牙周炎牙齦組織與健康牙齦相比,采用芯片法檢測發現6個microRNA(let-7a、let-7c、miR-130a、miR-301a、miR-520d和miR-548a)上調最明顯,可能與慢性牙周炎的發病機制密切相關。

    Xie等在臨床研究中發現,炎癥牙齦組織中10個microRNA(has-miR-126、has-miR-20a、has-miR-142-3p、has-miR-19a、has-miR-7f、has-miR-17、has-miR-146a、has-miR-146b、has-miR-203和has-miR-223)上調,has-miR-155和has-miR-205下調,靶向相關信號通路分析發現這12個microRNA與炎癥過程相關,包括炎癥信號轉導、白細胞黏附、血管增生、細胞增殖和凋亡、骨吸收等。

    Stoecklin-Wasmer等的類似研究也觀察到,牙周炎組織中has-miR-223明顯高表達,參與多種類型的癌癥、炎癥和自身免疫性疾?。ㄈ绨籽?、類風濕性關節炎和心血管疾病等)。隨后Ogata等比較了日本牙科患者中炎癥牙齦組織和非炎癥牙齦中micro-RNA的表達,發現hsa-miR-150、has-miR-223和hsa-miR-200b上調最明顯,而hsa-miR-379、hsamiR-199a-5p和hsa-miR-214下調最明顯,通過信號通路分析軟件interactive pathway analysis(IPA)分析發現,3個上調明顯的microRNA與炎癥性疾病、組織損傷、功能異常、泌尿系統疾病和癌癥相關。

    Venugopal等通過類似芯片法分析發現,牙周炎組織中let-7a和miR-21上調,而miR-100和miR-125b下調;通過生物信息學預測分析顯示4種microRNA共同靶向核因子(nuclear factor,NF)-κB通路,可調節牙周炎的發生。

    最近一項臨床研究比較了慢性和侵襲性牙周炎患者牙齦組織中microRNA表達譜,結果卻無明顯差異,但兩種牙周炎組織比起健康組織都有特異性microRNA高表達,表達最高的microRNA包括hsa-miR-1274b、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-720、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-17-3p和hsa-miR-21-3p,其中hsa-let-7b-5p、has-mir-17-3p、has-miR-21-3p和hsa-mir-19b-3p的水平升高與先前的其他研究結果相類似,具有調節細胞分化、影響骨代謝、調節炎癥等生物學功能。以上研究均揭示了牙周炎過程可誘導多種microRNA水平變化,可通過靶向相關信號途徑調控機體免疫反應,進而影響牙周炎的發生、發展。

    此外,特定microRNA的表達水平還與患者牙周炎的臨床嚴重程度相關,牙齦組織中miR-146a的表達水平與牙周探測深度和附著喪失呈正相關;當牙周炎患者接受治療后,齦溝液中miR-146a、miR-155水平下降。

    1.2 牙周炎患者全身循環系統中microRNA的表達特征

    牙周炎還可引起血清中microRNA水平變化,Yoneda等通過臨床病例對照研究比較了健康者和慢性牙周炎患者血清中microRNA水平,發現牙周炎組血清hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-501-5p和hsa-miR-21-3p高于對照組,hsa-mir-664a-3p、hsamir-501-5p和hsa-mir-21-3p的靶基因與糖尿病、心血管疾病和癌癥發生的途徑密切相關;同一課題組的動物研究發現,結扎建立實驗性大鼠牙周炎模型2周及4周時,血清中miR-207、miR-495、miR-376b-3p特異性升高,通過生物信息分析其靶基因及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信號通路和Wnt信號通路的情況, 通過受試者工作特征曲線來評估microRNA鑒別診斷牙周炎的能力,發現它們可作為牙周炎的血清生物標志物。上述結果提示了牙周炎狀態可引起全身microRNA表達水平變化,這可能是橋接慢性牙周炎與全身系統性疾病的分子機制之一。

    1.3 牙周炎與動脈粥樣硬化相關的microRNA表達特征

    在1項臨床病例對照研究中,患者被分為無慢性牙周炎的急性冠脈綜合征組、有慢性牙周炎的急性冠脈綜合征組、僅慢性牙周炎組和健康組,評估循環系統中miR-146a和促炎細胞因子的水平,結果顯示前3組的循環系統中miR-146a水平均升高,相關性分析發現有慢性牙周炎的急性冠脈綜合征組循環miR-146a水平與年齡、性別、吸煙、血脂異常、高血壓、糖尿病、體重指數等具有強相關性,且與血清中促炎因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6水平呈正相關。因此可認為miR-146a是調節牙周炎患者免疫炎癥反應的關鍵分子,其水平升高可能增加急性冠脈綜合征風險。

    這與Guo等的發現一致,急性冠脈綜合征患者外周血單核細胞中miR-146a的表達增加,體外實驗過表達miR-146a可顯著上調Th1細胞的功能及誘導動脈粥樣硬化中關鍵的促炎細胞因子和關鍵轉錄因子TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1、NF-κB p65蛋白的表達,猜測miR-146a可能是Th1細胞分化中的重要調節因子,與斑塊不穩定相關,易誘發急性冠脈綜合征。Nahid等通過動物研究分析比較了多種混合牙周病原體(牙齦卟啉單胞菌FDC 381、牙密螺旋體ATCC 35404、福賽斯坦納菌ATCC 43037)牙周感染載脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠與陰性感染組牙周及脾臟組織中microRNA表達譜變化,發現牙周致病菌感染可特異性增強ApoE-/-小鼠牙周組織和脾臟中miR-146a持續高表達,其中牙周組織中miR-146a升高尤為明顯,而mir-132和mir-155水平則無明顯變化。

    此外,牙周組織中并未發現TNF-α表達水平明顯變化,可能與牙周組織中高水平miR-146a相關,miR-146a的靶基因即編碼白細胞介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor related kinase,IRAK)的基因IRAK-1和編碼腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-related factor,TRAF)6的基因TRAF6的表達水平在牙周及脾臟中亦無明顯變化,猜測可能與miR-146a的轉錄后抑制作用相關。在另一牙齦卟啉單胞菌感染ApoE-/-小鼠模型中,發現心臟組織中miR-146b和miR-155相對表達升高。除牙齦卟啉單胞菌外,伴放線放線桿菌菌血癥也可加重ApoE-/-小鼠高脂血癥及炎癥反應,從而加速動脈粥樣硬化。

    Jia等的動物研究證明,伴放線放線桿菌可呈時間依賴性促進ApoE-/-小鼠中Th17細胞及其相關因子升高,并且誘導動脈中調節Th17細胞的miR-146b表達升高,提示伴放線放線桿菌可能通過增強miR-146b的表達來調節Th17細胞的分化,從而導致動脈粥樣硬化加重。

    2. microRNA在牙周致病菌與動脈粥樣硬化相關機制中的作用

    牙周致病菌可在血管內皮細胞和宿主免疫細胞中引發強烈的促炎反應,從而促進動脈粥樣硬化進程。動脈粥樣硬化的病理改變主要涉及內皮功能紊亂、巨噬細胞聚集、平滑肌細胞遷移與增殖、泡沫細胞形成。microRNA可通過調控動脈粥樣硬化相關細胞功能從而介導動脈粥樣硬化發生、發展的整個疾病過程。先前研究表明,特定的microRNA(如miR-155、miR-21、miR-146a/b和miR-132等)受牙周致病菌誘導,可作為調節先天免疫反應的重要組成部分,與血管炎癥反應和動脈粥樣硬化疾病進展相關。

    2.1 miR-146a/b

    miR-146a/b是先天免疫和適應性免疫反應中細胞分化和功能的重要調節劑,受促炎因子誘導產生。IRAK-1和TRAF6是TLR信號通路的關鍵成分,參與轉錄因子的激活,miR-146a/b可通過抑制這兩種結合蛋白,以NF-κB依賴性方式抑制巨噬細胞的炎癥反應,且與細菌免疫耐受相關。前面的研究表明牙周感染可導致局部和全身miR-146a/b上調,其水平可反映機體內炎癥狀態。體外研究可闡釋miR-146a/b調控牙周致病菌引發的免疫炎癥機制。

    Nahid等在體外實驗中驗證了miR-146a的表達模式和作用機制,采取熱滅菌和活的牙周病原體(牙齦卟啉單胞菌FDC 381、牙密螺旋體ATCC 35404、福賽斯坦納菌ATCC43037)分別及混合刺激人THP-1細胞,表現出與上述動物研究中類似的microRNA表達模式,單獨刺激和混合菌刺激均能誘導THP-1細胞中miR-146a水平顯著變化,呈時間依賴性升高,且活菌誘導程度更加強烈;然而同樣地,miR-132水平在牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌及其混合感染8~12 h時表達升高,而后逐漸下降,牙密螺旋體的單獨感染并不引起miR-132表達變化,miR-155水平均無明顯變化,由此看出,miR-146a是牙周致病菌感染中起主要調控作用的microRNA;對其調控機制進一步分析,感染過程中miR-146a升高靶向降低了IRAK-1和TRAF6表達水平,且與TNF-α表達水平呈負相關。

    Li等用大劑量牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激巨噬細胞后發現,細胞內miR-146a-5p水平顯著升高,并且誘導免疫耐受;過表達miR-146a-5p后,IRAK-1表達下調,并且抑制了脂多糖引起的膽固醇逆轉運蛋白ABCA1和ABCG1的失調,由于IRAK-1在小鼠巨噬細胞中參與了維甲酸受體介導的ABCA1通路,表明牙周致病菌可通過miR-146a介導的IRAK-1下調,提供炎癥和膽固醇代謝之間的橋梁。

    Molteni等探究了牙齦卟啉單胞菌脂多糖與TLR4相互作用過程中涉及的microRNA途徑,牙齦卟啉單胞菌脂多糖可誘導人THP-1細胞促炎性細胞因子釋放及miR-146a高表達,并能負性調控TLR4途徑。抑制TLR4激活雖能有效抑制促炎因子產生,但對miR-146a水平沒有影響,說明TLR4抑制劑可通過維持miR-146a的表達,調節牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導的促炎反應。然而,并非在所有情況下牙齦卟啉單胞菌脂多糖都可通過miR-146a發揮炎癥調控作用。

    另一項體外研究發現,牙齦卟啉單胞菌脂多糖雖然強烈誘導THP-1源巨噬細胞的miR-146a表達,然而抑制或過度表達miR-146a對細胞因子產生的影響很??;此外,miR-146a的潛在靶分子IRAK-1和TRAF6的表達也不受影響。這可能與巨噬細胞轉染效率過低以及感染指數不同相關,猜測牙齦卟啉單胞菌脂多糖通過激活TLR誘導miR-146a表達可能有利于細菌在巨噬細胞內存活,從而介導低度持續的炎癥。

    因此,miR-146a在牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激的巨噬細胞中的作用尚無定論,值得進一步探究。以上研究表明,miR-146a/b在牙周致病菌誘導的動脈粥樣硬化過程中可能起重要的抑炎作用,并能調節動脈粥樣硬化相關的膽固醇代謝,其失調可能導致動脈粥樣硬化疾病的進一步進展。

    2.2 miR-21

    miR-21在多種心血管疾病中表達增加,臨床研究表明動脈粥樣硬化患者血清中miR-21水平可作為動脈粥樣硬化疾病的新型標志物之一。它可表達于多種心血管相關細胞(包括心肌細胞、心肌成纖維細胞、血管平滑肌細胞、人臍靜脈內皮細胞以及巨噬細胞),在動脈粥樣硬化的發生、發展中具有保護作用。

    研究發現,小鼠動脈粥樣硬化病損處巨噬細胞中miR-21含量增加;敲除miR-21可引起巨噬細胞凋亡,并抑制巨噬細胞清除凋亡細胞作用,促進ABCG1降解,泡沫細胞增加,引發血管炎癥和斑塊壞死,加速動脈粥樣硬化。巨噬細胞/單核細胞中,miR-21上調通常與病毒、細菌和其他分子模式的刺激有關,并在先天免疫過程中發揮重要作用。炎癥反應中,miR-21是NF-κB的直接靶標,脂多糖引起的NF-κB的激活可誘導miR-21的表達,而miR-21水平升高反過來顯著抑制NF-κB激活,負性調控炎癥反應,因此miR-21是巨噬細胞中重要的抑炎調節因子。

    巨噬細胞吞噬凋亡細胞過程也能誘導miR-21產生,miR-21可通過靶向抑制抑癌基因PTEN的表達,抑制促炎性NF-κB-TNF-α途徑從而發揮抑炎效應,miR-21還可通過抑制程序性細胞死亡因子PDCD4基因,激活cJun-AP-1途徑,增強抑炎因子IL-10表達。

    miR-21在平滑肌細胞中也可作為抗凋亡因子。研究表明,miR-21可以通過抑制靶基因PTEN的表達,激活細胞生存相關信號通路PI3K/Akt通路,升高抑凋亡基因Bcl-2的表達,從而促進細胞增殖和生存。除了抑炎抑凋亡作用,某些情況下miR-21表現為促凋亡作用。在結核分枝桿菌感染的樹突狀細胞中,miR-21可通過靶向抑制抑凋亡蛋白Bcl-2促進樹突狀細胞凋亡。在卡介苗感染的巨噬細胞中,miR-21對TLR4/MyD88信號轉導途徑具有負調節作用,過表達miR-21導致細胞存活率下降,細胞凋亡增加,炎癥因子水平升高。由此可見,牙周致病菌誘導的miR-21水平改變,可能通過miR-21調控細胞炎癥與凋亡的機制,影響動脈粥樣硬化的發展。

    有研究表明,巨噬細胞在經牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激后,miR-21表達上調,過表達miR-21抑制靶基因PDCD4表達,從而抑制巨噬細胞產生促炎性細胞因子;抑制miR-21,可通過激活NF-κB提高促炎性細胞因子的產生。說明miR-21在牙齦卟啉單胞菌脂多糖引起的巨噬細胞炎癥反應中具有重要的保護作用。此外,有研究指出,牙齦卟啉單胞菌的唾液酸酶缺乏株與正常菌株相比,可通過下調巨噬細胞補體受體CR3識別病原分子,誘導細胞內GAS5(一種長鏈非編碼RNA)水平升高,靶向抑制miR-21水平,從而解除miR-21的抑炎作用,促使細胞分泌細胞因子IL-12,并且上調巨噬細胞吞噬清除能力。

    由此可見,牙周致病菌可通過上調巨噬細胞中miR-21水平防止過度炎癥反應,但同一牙周致病菌不同菌種的蛋白質活性差異可引起細胞內miR-21水平差異,導致功能變化,從而介導疾病的不同轉歸。

    2.3 其他microRNA

    其他microRNA分子也參與了牙周致病菌感染與動脈粥樣硬化相關的免疫調控過程。microRNA表達譜分析表明,牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277感染可引起小鼠巨噬細胞中miR-7674-5p、miR-6975-5p、miR-3473b、miR-3473e和miR-155-5p水平明顯上調,以及miR-8109、miR-2137和miR-211-3p下調。通過抑制和過表達實驗發現,miR-155p和miR-2137可調節細胞因子分泌,miR-155-5p上調顯著抑制TNF-α的分泌,miR-2137水平下降則促進抑炎因子IL-10的分泌。

    牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277還可誘導THP-1源性巨噬細胞高表達miR-128,通過抑制p38-MAPK途徑介導內毒素耐受,抑制過度炎癥反應,從而減少組織損傷。在另一項研究中,牙齦卟啉單胞菌FDC381刺激THP-1源性巨噬細胞,通過TLR介導和激活NF-κB,誘導miR-132的高表達;繼而通過靶向抑制TNF-α的靶基因NFE2L2和NFAT5,從而強烈抑制促炎因子TNF-α的作用。

    除活菌刺激外,不同牙周致病菌脂多糖結構差異也能導致巨噬細胞microRNA表達譜差異。人巨噬細胞分別受伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激后,其microRNA表達譜呈現不同,這可能與伴放線放線桿菌脂多糖只特異性激活TLR4信號轉導,而牙齦卟啉單胞菌脂多糖可同時結合并誘導TLR2、TLR4及TLR7信號轉導相關。

    通過篩選共同目標microRNA,發現miR-29b、miR-32、miR-891和let-7表達水平隨脂多糖刺激濃度、類型和時間變化,其中miR-29b和let-7f可分別靶向調節炎癥和免疫相關的2個關鍵基因IL6Rα和SOCS4并調節細胞內蛋白質水平。IL6Rα在IL-6信號轉導中起決定性作用,可增強IL-6信號轉導;SOCS蛋白家族主要通過酪氨酸激酶的去磷酸化調節細胞因子轉導,二者在維持免疫應答中起關鍵作用。

    在另一項研究中,伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌脂多糖以及香煙提取物修飾后的牙齦卟啉單胞菌脂多糖分別刺激人原代巨噬細胞,發現脂多糖結構不同具有改變細胞因子產生和microRNA表達的能力,并影響巨噬細胞活化方式,miR-24在脂多糖刺激下被顯著誘導,其中牙齦卟啉單胞菌CSE刺激后上調最明顯,它是巨噬細胞經典激活的負調節因子,可在巨噬細胞極化狀態下促進替代途徑激活,具有抗炎作用。

    除巨噬細胞外,不同來源的平滑肌細胞對牙周致病菌的刺激反應也不同,用滅活的輕鏈球菌、血球鏈球菌、格氏鏈球菌、伴放線放線桿菌和牙齦卟啉單胞菌分別刺激健康者和動脈粥樣硬化斑塊來源的平滑肌細胞并觀察炎癥反應,發現不同來源的平滑肌細胞中microRNA表達水平有差異,其中鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌刺激正常和動脈粥樣硬化平滑肌細胞,有4個microRNA(miR-181b-5p、miR-186-5p、miR-28-5p和miR-155-5p)的表達存在顯著差異;其中3個microRNA的表達(miR-155-5p、miR-50-5p和miR-9-5p)與IL-6水平具相關性;生物信息分析顯示,這些microRNA的靶基因主要與細胞凋亡、增殖、黏附、遷移等相關,介導動脈粥樣硬化的發展。

    由此可見,多種牙周致病菌及其脂多糖刺激動脈粥樣硬化相關細胞均可引起microRNA表達變化,將在表觀遺傳學水平上參與免疫炎癥和細胞生物功能調控,進而影響動脈粥樣硬化的發生、發展。但由于microRNA的表達具有高度時間及細胞特異性,不同菌種、同一菌種的不同菌株和存在結構差異的細菌脂多糖,以及受刺激的細胞種類及來源不同,都能引起細胞內microRNA表達水平差異,而細胞內不同microRNA特異性高表達將介導對牙周致病菌不同的免疫調控反應。此外,由于microRNA表達的組織和疾病特異性,通過靶向輸送或抑制microRNA表達參與疾病調控正成為極具前景的治療方法。

    通過臨床前研究發現,在動脈粥樣硬化模型小鼠體內試驗microRNA療法,抑制某些特定miRNA(例如miR-148a、miR-122、miR-33、miR-155等)或過表達某些miRNA(例如miR-30c、miR-126-5p等),可改善動脈粥樣硬化相關危險因素和炎癥狀態,減輕病損程度,這反映了microRNA在治療動脈粥樣硬化相關疾病中的潛力。上述研究結果提示,掌握與牙周病原體相關的microRNA表達模式將有利于發掘牙周致病菌與動脈粥樣硬化之間真正的機制關聯,為動脈粥樣硬化疾病的預防及治療提供新的思路。

    3.總結

    牙周致病菌如何加速動脈粥樣硬化依然是當今的研究熱點,現大部分機制研究著眼于內皮功能障礙、全身炎癥、氧化應激、泡沫細胞形成、脂質積累、血管重塑和動脈粥樣硬化等病理生化分析,而從表觀遺傳學水平上研究牙周致病菌如何通過microRNA影響心血管系統的具體調控機制目前尚處于探索階段。例如牙周致病菌是直接侵入心血管系統引發microRNA水平變化進而調控相關基因表達,還是通過局部感染引發血液中micro-RNA水平升高間接作用于心血管系統?其中micro-RNA復雜而精細的調控網絡有更加深入挖掘的價值。

    從另一角度上看,由于血清中microRNA水平的穩定性,將牙周病原體相關的microRNA表達模式與其他炎癥性疾病引起的microRNA表達譜變化加以區分,有助于使這些非編碼RNA成為具有診斷價值的生物標志物,并有望作為新的治療靶點針對動脈粥樣硬化相關疾病進行個性化治療。

編輯: 陸美鳳

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